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月季不同途径再生体系的建立与优化及遗传转化的研究_图文

归档日期:07-15       文本归类:弹匣座      文章编辑:爱尚语录

  Different ways to establish and optimize regeneration system and studies

  本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料,指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明,并表示了谢意。

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  摘要…………………………………………………………………………………………………………………….1

  Abstract…………….…………………………………………………………………………………………………:;

  缩略词表………………………………………………………………………………….6 第一章文献综述………………………………………………………………………..7

  引言…………………………………………………………………………………………………………7

  2植株再生的研究概述……………………………………………………………7 2.1植物器官发生途径的再生研究……………………………………………8 2.2植物体细胞胚发生途径的再生研究………………………………………8 2.2.1植物体细胞胚发生的方式和特点……………………………………9 2.2.2影响植物体细胞胚发生的因素………………………………………9 2.2.2.1基因型对体细胞胚发生的影响……………………………….9 2.2.2.2外植体对体细胞胚发生的影响………………………………10 2.2.2.3培养基对体细胞胚发生的影响………………………………10 2.2.2.4培养条件对体细胞胚发生的影响……………………………11 3月季植株再生的研究概述………………………………………………………12 3.1月季器官发生途径的植株再生……………………………………………12 3.2月季体细胞胚发生途径的植株再生……………………………………。13 4植物遗传转化的研究概述……………………………………………………..14 5月季遗传转化的研究…………………………………………………………。16 6本研究的目的和意义…………………………………………………………。17 第二章月季叶片直接再生体系的优化……………………………………………….1 8 1材料与方法………………………………………………………………………l 8 1.1实验材料…………………………………………………………………..1 8 1.2培养条件和基本培养基…………………………………………………..1 8 1.3实验方法…………………………………………………………………..1 9 1.3.1外植体消毒………………………………………………………….19 1.3.2暗培养时间对月季品种‘萨蔓莎’植株再生的影响…………….19 1.3.3基因型与TDZ和NAA不同浓度组合对月季植株再生的影响….19

  1.4数据统计与分析……………………………………………………………20 2.结果与分析…………………………………………………………………………20 2.1暗培养时间对月季品种‘萨蔓莎’植株再生的影响分析………………20 2.2基因型与TDZ和NAA不同浓度组合对月季植株再生的影响分析…..21

  讨论…………………………………….………………………………………………………………….23 3.1暗培养时间对月季植株再生的影响………………………………………23 3.2基因型对月季植株再生的影响……………………………………………24 3.3植物生长调节剂对月季植株再生的影响…………………………………24

  三章月季体细胞胚发生途径再生体系的建立……………………………………..25 1材料与方法……………………………………………………………………….25 1.1实验材料……………………………………………………………………25 1.2培养条件和基本培养基………………………………………………………27 1.3实验方法……………………………………………………………………27 1.3.1外植体消毒…………………………………………………………。27 1.3.2基因型与不同浓度2,4.D对月季体细胞胚发生的影响………….27 1.3.3基因型与2,4.D和BA不同浓度组合对月季体细胞胚发生的影响27 1.3.4培养条件对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响………………。28 1.3.4.1光照条件对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响…………28 1.3.4.2碳源对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响………………28 1.3.4.3外源激素对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响…………28 1.3.5体细胞胚的萌发和植株再生………………………………………..28 1.3.5.1月季‘萨蔓莎’体细胞胚的萌发和植株再生………………28 1.3.5.2月季‘紫雾’ 及藤本月季体细胞胚的萌发和植株再生…..28

  1.4数据统计与分析……………………………………………………………30 2结果与分析………………………………………………………………………30 2.1基因型与不同浓度2,4.D对月季体细胞胚发生的影响…………………30 2.2基因型与2,4.D和BA不同浓度组合对月季体细胞胚发生的影响……30 2.3培养条件对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响………………………32 2.3.1光照条件对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响…………………32

  2.3.2碳源对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响…………………….32 2.3.3外源激素对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响……………….32 2.4体细胞胚的萌发和植株再生……………………………………………。34 2.4.1月季‘萨蔓莎’体细胞胚的萌发和植株再生…………………….34 2.4.2月季‘紫雾’及藤本月季体细胞胚的萌发和植株再生………….36 3讨论……………………………………………………………………………………………………….38 3.1基因型和外植体类型对体细胞胚诱导的影响…………………………..38 3.2植物生长调节剂对体细胞胚诱导的影响………………………………..39 3-3体细胞胚的增殖…………………………………………………………..40 3.4基因型和外植体类型对体细胞胚萌发和植株再生的影响……………。41 3.5植物生长调节剂对体细胞胚萌发和植株再生的影响…………………。41 第四章月季遗传转化的研究………………………………………………………….43 l材料与方法……………………………………………………………………..43 1.1实验材料…………………………………………………………………。43 1.1.1转化受体材料……………………………………………………….43 1.1.2供试农杆菌菌株和质粒…………………………………………….43 1.1.3根癌农杆菌的培养…………………………………………………..44 1.1.3.1农杆菌菌株的活化……………………………………………44 1.1.3.2农杆菌菌株的保存……………………………………………44 1.1.4主要生化试剂………………………………………………………..44

  1.2转化实验所用培养基配方………………………………………………..44

  LB培养基配方………………………………………………………44 AB液体培养基配方…………………………………………………44

  1.2.3月季转化实验中植物组织培养基配方……………………………45 1.3农杆菌介导的遗传转化方法………………………………………………45 1.3.1农杆菌侵染液的制备………………………………………………45 1.3.2以月季‘萨蔓莎’叶片为受体的遗传转化………………………46 1.3.2.1受体的侵染和共培养………………………………………。46

  1.3.2.2脱菌及选择培养………………………………………………46 1.3.3以月季‘紫雾’体细胞胚为受体的遗传转化…………………….46 1.3.3.1月季‘紫雾’体细胞胚对Km的敏感性分析………………46 1.3.3.2月季‘紫雾’体细胞胚对Cef的敏感性分析………………46 1.3.3.3侵染时间对转化效率的影响…………………………………46 1.3.3.4共培养时间对转化效率的影响………………………………47

  1.5数据统计与分析……………………………………………………………47 2结果与分析………………………………………………………………………47 2.1以月季‘萨蔓莎’叶片为受体的遗传转化………………………………47 2.2以月季‘紫雾’体细胞胚为受体的遗传转化……………………………48 2.2.1月季‘紫雾’体细胞胚对Km的敏感性分析…………………….48 2.2.2月季‘紫雾’体细胞胚对Cef的敏感性分析…………………….49 2.2.3侵染时间对转化效率的影响……………………………………….49 2.2.4共培养时间对转化效率的影响…………………………………….50 3讨论………………………………………………………………………………………………………….5 1 3.1农杆菌介导法进行月季遗传转化的影响因素……………………………51 3.2月季不同的转化受体系统比较……………………………………………53 参考文献…………………………………………………………………………………54 致谢……………………………………………………………………………………………………………………65

  月季(Rosa hybrida)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)多年生常绿木本植 物。因其花色艳丽,花朵优美,芳香,被誉为中国传统十大名花之~,具有很高的 观赏价值和商业价值。但月季的花朵瓶插寿命比较短,植株易患白粉病、黑斑病, 这些都影响了它的观赏价值和经济价值。植物基因工程技术可以克服传统育种方法 的局限性。高效而稳定的植株再生体系是植物遗传转化获得成功的重要前提条件。 本实验对月季叶片直接再生体系进行了优化,并以不同月季品种的叶片和未成熟合 子胚为外植体,建立了月季体细胞胚发生途径再生体系。同时利用叶片直接再生系 统和体细胞胚发生再生系统两种再生体系进行月季遗传转化的研究。其主要的研究 结果如下: 1.月季叶片直接再生体系的优化 以月季‘萨蔓莎’、 ‘伊丽莎白’、 ‘黑夫人’的小叶片为外植体,对月季不

  定芽的诱导和植株再生进行了优化研究。研究结果表明:3个月季品种的小叶片在诱 导培养基1/2MS+1.0mg/L TDZ+0.05mg/L

  Glucose+0.25%GEL黑暗培养lOd后转入光照条件下培养,在诱导培养基上培养20d 后,将不定芽转入到扩繁培养基MS+0.5mg/L

  Sucrose+7.59/LAgar继续培养,其不定芽诱导率和植株再生率都达到了最高。不定芽 诱导率‘萨蔓莎’最高为85.04%, ‘伊丽莎白’最高为95.30%, ‘黑夫人’最高为

  81.70%;其植株再生率‘萨蔓莎’最高为60.09%,‘伊丽莎白’最高为64.49%,‘黑 夫人’最高为55.33%。 2.月季体细胞胚发生途径再生体系的建立 以不同月季品种的小叶片和未成熟合子胚为外植体,对影响体细胞胚诱导、增 殖及植株再生等条件进行了研究。研究结果表明:基因型、外植体类型、植物生长 调节剂和培养条件对体细胞胚诱导和植株再生都产生着重要影响。以叶片为外植体 进行体细胞胚诱导时,只有月季‘萨蔓莎’的小叶片有体细胞胚发生;以未成熟合 子胚为外植体进行体细胞胚诱导时,获得体细胞胚的月季品种有‘紫雾’、‘小黄花’

  3.不同受体的月季遗传转化的研究 以月季‘萨蔓莎’小叶片作为农杆菌介导遗传转化的受体,利用上述优化了的 叶片直接再生体系,进行了遗传转化的研究。在选择诱导培养基1/2MS+1.OmgIL

  TDZ+O.05mg/L NAA+IOOmg/L CH+10mg/L AgN03+300mg/L Cef+25mg/L Km+3%

  Glucose+0.25%GEL上虽然获得了少数不定芽,但不定芽在继续培养中死亡,未得 到再生的植株。以月季‘紫雾’体细胞胚作为农杆菌介导遗传转化的受体,通过对 共培养后GUS基因瞬间表达率的分析,对其遗传转化进行了初步研究,其研究结 果表明:侵染40min,共培养3d,75mg/L Km和300meffL Cef的条件下遗传转化效 果最好。 关键词:月季;叶片;未成熟合子胚;直接再生;体细胞胚发生;遗传转化

  Different ways to establish and optimize regeneration system and studies

  genetic transformation in Rosa hybrida

  of Chinese ten famous and traditional flowers,is

  Rosaceae family,SO it has high ornamental and commercial value.However,

  life ofrose flower is short,and the plants

  black spot,which all affect its ornamental and economic value.Plant genetic engineering technology stable

  overcome the limitations of traditional breeding methods.Efficient and system is

  Besides,using leaflets and immature zygotic embryos of different cultivars of R.hybrida

  embryogenesis were used for the study of genetic

  results of this study were as follows:

  I.Enhancement of direct organogenesis system in R.hybrida.

  of R.hybrida‘Samantha’,‘Elizabeth’,‘Black Lady’as explants Was studied.The results showed that:when excised leaflets were cultured TDZ+0.05mg/L NAA+1 00mg/L CH+1 0mg/L

  NAA+O.1 mg/L GA3+3%Sucrose+7.59/L Agar,the frequency of adventitious induction and

  regeneration all reached the highest.The

  of‘Samantha’,‘Elizabeth’and‘Black Lady’Was 85.04%,95.30%and

  2.A regeneration system via somatic embryogenesis was established for R.hybrida Using the leaflets and immature zygotic embryos of different cultivars of R.hybrida

  somatic embryogenesis,proliferation and plant

  regeneration were studied.The results showed regulators

  that:genotype,explant type,plant growth

  cultivation conditions all played important roles in somatic embryogenesis the leaflets

  observed in R.hybrida‘Samantha’;Using the immature zygotic embryos as explants, somatic embryogenesis Was observed in R.hybrida‘Purple Haze’,‘Small yellow

  Climbing rose.The frequency of somatic embryogenesis had significant cultured

  the medium MS+3.0mg/L 2,4-D+3%Glucose+0.25%

  GEL,leaflets of‘Samantha’showed the highest induction zygotic embryos of‘Purple Haze’cultured Glucose+0.25%GEL showed the highest Climbing

  highest frequency of germination of somatic embryos in R.

  hybrida‘Samantha’,‘Purple Haze’and Climbing

  regeneration per somatic embryo in R.

  hybrida‘Samantha’,‘Purple Haze’and Climbing

  respectively.During the processes of germination of somatic embryos regeneration,germination of somatic embryos in‘Samantha’only generated weak Climbing

  roots,which needed rooting.However,‘Purple Haze’and and shoots simultaneously,then generated complete

  3.Studies of genetic transformation in Based

  the enhanced direct organogenesis system,some transgenic buds were

  transformation of leaflets using GUS as a scorable

  NAA+1 00mg/L CH+l Omg/L AgN03+300mg/L Cef+25mg/L Kin+3%Glucose+0.25% GEL,however,these buds did not regenerate into plantlets.Using somatic embryos of ‘Purple Haze’嬲inoculation material,an Agrobacterium—mediated transformation

  protocol WaS studied for R.hybrida by aSsessing the transient expression of GUS gene.

  The results showed that:infected for 40 min,CO-cultured for

  75mg/L Km and 300mg/L Cef were optimal for transgenic system.

  K呵words:Rose(Rosa hybrida);Leaflet explants;Immature zygotic embryos;Direct

  organogenesis;Somatic embryogenesis;Genetic

  2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Abscisic acid Activated charcoal silver nitrate

  Acetosyringone Gamborg et a1.(1968)(medium) 6-Benzylaminopurine Cefotaxime Casein hydrolysate Gibberellic acid Phytagel Green fluorescent protein

  Hygromycin B lndole?3?butyric acid Kanamycin

  Polyethylene glycol Plant growth regulator Thidiazuron

  月季(Rosa hybrida)属于蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)多年生常绿木本

  植物:月季栽培历史悠久,被世界各国广泛种植,是非常重要的观赏花卉且具有重 要的商业价值,在园林绿化中起着重要的作用。月季的用途非常广泛,例如可以用 藤本月季布置长廊和拱门,用树状月季装饰主干道,将灌木月季做成绿篱,用聚花 月季点缀花坛,茶香月季可以用于展览,微型月季用来作为室内陈设,切花月季可 以应用于各种场所。此外,月季还可以做成香料,其花朵或花瓣可以腌制成食品(谭 文澄和戴策刚,1997)。月季因其姿态优美、花色丰富艳丽,芳香浓郁、花期长、 适应性强、繁殖容易且管理方便被誉为花中皇后,是中国的传统十大名花之一,在 我国以月季作为市花的城市数目居全国之首(张本,1998)。随着人们生活水平的 提高,人们对月季品种观赏性状的要求也越来越高,因此,月季育种是花卉育种中 最活跃的领域之一。 月季的育种目标主要集中在对花色、花形、花香、花期、株型、鲜切花寿命和 抗病性等方面。但由于月季的染色体数目和倍数的差异造成远缘杂交的困难,使得 传统的育种方法存在一定的局限性。90年代兴起的转基因技术为月季品种的改良提 供了新的途径。目前月季组织培养的理论和技术已经取得了重大进展,利用基因工程 技术对月季品种进行定向改良从而培育出大量新品种势在必行。

  1902年,德国的著名植物学家Haberlandt提出了细胞全能性的观点:每一个具 有细胞核的植物细胞都具有发育成为完整植株的能力。30年代,White用番茄的根 通过组织培养成功地建立了首个无性繁殖系,从而证实了细胞全能性的观点。自此, 植物组织培养技术得到了广泛的研究。通过组织培养技术将离体的细胞、组织、器 官或合子胚发育成为完整的植株称为植物的再生。高效的植株再生体系是进行植物 遗传转化的基础,因此对植株再生的研究具有重要意义。植株再生可以通过植物的 器官发生途径和体细胞胚发生途径进行。

  植物的器官发生是指在离体培养条件下,从单个细胞或多个细胞诱导出植物的 茎和根从而发育成完整植株的过程。植物的器官发生包括直接器官发生和间接器官 发生,前者指利用外植体上直接诱导不定芽而后发育成植株的过程,后者指利用外 植体先诱导愈伤,再通过愈伤分化形成不定芽从而发育成植株的过程。 不同的外植体的器官发生对激素配比的要求不同(徐廷玉等,1989)。细胞分 裂素和生长素的比值不同,其诱导的结果也不同,比值高时有利于芽的形成,比值 低时有利于根的形成,当两者含量近似时有利于愈伤组织的诱导和分化。近年来大 多数研究表明,TDZ对叶片不定芽的诱导起着重要的作用。在以杏的叶片为外植体 进行不定芽诱导时,TDZ对不定芽的诱导有明显的促进作用,而BA对不定芽诱导 有抑制作用,在添加BA的培养基上不定芽诱导率明显下降(Olaya et

  但也有研究表明BA对不定芽的诱导有着明显的促进作用。在以酸樱桃和甜樱桃不 同品种的叶片为外植体进行不定芽诱导的研究中,在添加2me,/L BA的WPM培养 基上叶片不定芽诱导率显著高于添加TDZ的培养基(Tang

  外植体类型、基因型对其器官发生的频率影响效果也非常明显。例如,在诱导 黄瓜的直接器官发生时,其子叶节可形成大量丛生芽,而叶片和下胚轴都不能分化 出不定芽,而且品种长春密刺和龙杂黄7号比叶三旱黄瓜和老来少发生频率要高(侯 爱菊,2003)。因此,要建立一个高效的植株再生体系,对培养基种类和成分、外 植体和培养条件的选择都至关重要(谭文澄和戴策刚,1997)。

  植物体细胞胚发生(somatic embryogenesis),主要是指在离体培养条件下,单 倍的或者双倍的体细胞未经过配子融合而是通过与合子胚发生类似的途径发育成 为新个体的形态发生过程(Tactics,1978;Williams

  来源于体细胞,所以被称为体细胞胚或胚状体。Reinert(1958)和Steward(1958) 分别从胡萝卜的愈伤组织和胡萝卜的悬浮细胞系中成功获得了体细胞胚,并通过此 途径再生成为了完整的植株。这一重大的突破使得植物细胞的全能性得到证实,从 而为植物通过离体培养再生植株开辟了新的纪元。随后,许多学者在这一新的领域 进行研究并取得了大量的成果。目前已经200多种植物获得了体细胞胚(贾彩凤等,

  近年来,有关植物体细胞胚发生的研究成果不断被报道。对影响体细胞胚发生 的因素的研究已经成为当前植物生物技术的一个研究热点。建立高频的体细胞胚发 生体系具有重要的意义。利用胚性细胞系可以进行种质保存,进行突变体的诱导和 筛选,同时也是进行植物遗传转化的重要受体材料。 2.2.1植物体细胞胚发生的方式和特点 体细胞胚的发生方式分为两种,直接体细胞胚发生和间接体细胞胚发生。直接 体细胞胚发生是指体细胞胚从组织或细胞直接发生,而不经过愈伤组织阶段;间接 体细胞胚发生是指植物的外植体经过愈伤组织阶段,这些愈伤组织再经分化发育成 为体细胞胚。据报道,70%的植物体细胞胚是通过间接途径发生的,22%的植物体 细胞胚是通过直接途径发生的,而在8%的植物中,体细胞胚既可以通过直接途径发

  关于体细胞胚的起源问题,一种观点认为是起源于单个的胚性细胞,另一种认 为是起源于胚性细胞团。目前支持单细胞起源的例证较多,但无论何种起源,由体 细胞胚发育成的植株其各部分具有在遗传组成上是一致且不存在嵌合现象的特点。 与器官发生途径相比,体细胞胚发生具有速度快、数量多、结构完整且再生率高和 操作简单等特点(朱徽,1978)。体细胞胚是在离体条件下植物细胞、组织或器官 培养的产物,它具有完整两极结构。体细胞胚与无融合生殖的胚不同,也不同于组 织培养过程中形成的不定芽和不定根,并且与合子胚存在着本质的区别,但它的发 育过程与合子胚的发育过程极为相似,即都经历了球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子 叶期胚。植物的体细胞胚发生途径是植物细胞全能性最完全的一种表达方式,它在 表明体细胞具有植物的全套遗传信息的同时还证实了体细胞胚发生的过程具有合子 胚形态发生过程的特点(崔凯荣和戴若兰,2000)。 2.2.2影响植物体细胞胚发生的因素 2.2.2.1基因型对体细胞胚发生的影响 基因型是植物体细胞胚发生和植株再生的首要影响因素(Jain

  理论上讲,任何植物都能够诱导体细胞胚发生并再生成为完整的植物。但实际的研 究结果表明,不同科属植物的体细胞胚发生条件,诱导的难易程度都存在着很大差

  2002)、玉米(Ozcan,2002)等多种植物中也都有关于因为植物基因型不同而使体 细胞胚发生频率不同的报道。因此,选择合适的基因型进行体细胞胚的诱导和植株 再生是实验成功的重要前提。 2.2.2.2外植体对体细胞胚发生的影响 植物的根、茎段、叶片、子叶、子叶节、下胚轴、花瓣、花药、花丝、合子胚、 各种单细胞、游离的小孢子、原生质体都可以作为诱导体细胞胚发生的外植体。在 植物体细胞胚发生和植株再生的研究报道中,外植体的类型(Ipekci

  Wetzstein,1 998;Molina et a1.,2002;Rines and McCoy,1 98 1)对体细胞胚的发生都产

  生了重要影响。一般来讲,通过合子胚诱导体细胞胚发生的频率要高于其他植物组 织。有研究表明在对葡萄的体细胞胚诱导时,利用花组织尤其是花药、花丝,未受 精的子房(胚珠)、合子胚比较容易诱导,叶片、叶柄、茎尖、卷须虽有应用但比 较少,而在这些材料中以细胞分裂旺盛的幼嫩组织为好(闫爱玲等,2008)。在花 胞胚发生的研究中,不同产地的花楸体细胞胚发生频率存在着差异,且未成 胚的诱导率要高于成熟胚的诱导率(张建瑛,2007)。但在体细胞胚发生的 合子胚成熟度的关系上也有相反的报道(Turgut 植体也是体细胞胚发生成功的关键因素之一。 3培养基对体细胞胚发生的影响 养基的种类和成分对植物体细胞胚的发生产生着重要影响,也是目前研究最 面。其影响因素主要包括以下几个方面:培养基的种类、碳源、活性炭及植 和生长调节剂。有关培养基的种类和植物激素和生长调节剂等方面的研究最

  多。基本培养基主要有MS、1/2MS、B5、N6、WPM等。因其培养基的组分不同, 对植物体细胞胚发生的影响也不同。 栓皮栎的未成熟合子胚在MS培养基上的诱导的体细胞胚数目和发生频率都要 优于WPM培养基(张存旭,2005)。在火炬松体细胞胚诱导的研究中,其合子胚在 BM培养基、DCRl培养基和LP培养基上的体细胞胚发生频率存在着明显的差异(Li

  a1..1998)。植物激素和生长调节剂对体细胞胚的发生和植株再生都有着重要影响

  a1..1998)。在植物激素中,细胞分裂素和生长素共同控制着植物细胞的分裂

  和分化,在体细胞胚诱导和植株再生的研究中的应用最为广泛。其中在体细胞胚诱 导时大多应用了2,4.D,但2,4.D在体细胞胚发育过程中的作用具有阶段性,即在诱 导阶段通常具有促进作用,而在体细胞胚成熟和萌发阶段往往起抑制作用,并且体 细胞胚长期在含2,4.D的培养基中培养会丧失其成熟和再生能力。Lakshrnanan和Taji (2000)在对豆科植物体细胞胚诱导研究中的发现,大多数植物在体细胞胚诱导时 需要生长素尤其是2,4.D的作用,但在个别植物中,IAA的诱导效果要优于2,4.D。 有研究还表明2,4.D在豆类的有些植物中会导致体细胞胚畸形的发生,从而使体细胞 胚再生植株困难。除此之外,ABA、乙烯、GA3对植物体细胞胚的成熟和萌发也起 着重要作用(Jimenez,2005)。在对云杉属植物体细胞胚发生的研究中,ABA对体 细胞胚过早萌发起着明显的抑制作用,因为其对子叶期胚中贮藏蛋白的积累有促进 作用(Roberts,1991)。在大豆体细胞胚的培养过程中发现,ABA对体细胞胚的进 发育和成熟起着促进作用(Tian

  通过培养基的更新也可以提高体细胞胚发生的频率(施雪萍,2009)。 2.2.2.4培养条件对体细胞胚发生的影响 培养的温度和光照条件对植物体细胞胚发生和植株再生也起着重要作用。一般 情况下最适宜的温度为25+20C。而有些植物在低温或高温的逆境处理条件下体细胞 胚的诱导或发育反而较为容易。例如,Decout

  菊苣的叶片进行培养时,有愈伤组织和不定芽产生,而将其叶片放在300C条件下培 养时,叶片在相同培养基上除了有愈伤组织和不定芽产生外,还有体细胞胚的发生, 而当温度上升N350C时,却只获得了体细胞胚。在对斜茎黄耆的细胞悬浮培养时发 现,当将其悬浮液置于80C的条件下进行2.3周冷处理后,体细胞胚发生频率得到明 显的提高(Luo et a1.,2003)。枫香体细胞胚胚根的萌发实验研究证明,低温处理对

  2004)发现冬青栎的体细胞胚在40C低温条件下处理后,其萌发率得到显著提高。 外,植物体细胞胚的发生、发育和成熟对光照条件也有着严格的要求。在拟南芥 合子胚体细胞胚诱导实验研究表明,在黑暗条件下体细胞胚的诱导率要高于光照 件下的诱导率(6aj,2002)。因此,适宜的培养条件对植物体细胞胚的发生和植 再生也至关重要。

  月季植株再生体系可以通过器官发生途径和体细胞胚发生两种途径建立。1967 年,Hill首次从月季Rosahybrida‘The Doctor’愈伤组织诱导出了胚状体(Hill,1967)。 随后国外的研究者利用不同的外植体和再生途径都成功地建立了月季的再生体系。 国内对月季组织培养的研究主要集中在通过腋芽萌发途径进行的离体快繁上(李海 燕等,2004),通过器官发生途径进行月季植株再生的研究近几年也有多篇论文报 道(高莉萍,2004;瞿素萍等,2007),而通过体细胞胚途径进行月季植株再生的 研究报道在国内极为少见。

  a1.(1995;1997)利用月季的叶片直接再生不定芽,这是目前所报道

  的再生率最高,所需时间最短的方法。研究中,他们以田间未展开的幼嫩复叶为外 植体进行消毒,然后将其切成带叶柄的小叶片,小叶片在诱导培养基1/2MS+1.5mg/L

  BA+o.01mg/L NAA+0.1mg/L GAa qb在光照条件下

  培养,不定芽长成植株。研究中的24个月季品种其不定芽的再生率为65%.100%不等。 品种的不定芽再生率越高,其再生所需要的时间越短,诱导再生的不定芽生长的也 越快,再生不定芽的数目越多。而且以田间苗的叶片诱导的效果要优于试管苗。有 的研究在此方法的基础上做了适当的调整,从而使试管苗叶片的不定芽的再生频率 得到了明显提高(Ibrhami

  成功地建立了月季品种‘萨蔓莎’直接器官发生途径的植株再生体系,研究中分别 以月季品种‘萨蔓莎’、 ‘红衣主教’、 ‘金奖章’和‘黄和平’的小叶片或复叶

  柄为外植体,对基因型、外植体、叶位、暗培养时间和植物生长调节剂等因素对不

  定芽诱导和植株再生的影响进行了研究。实验结果表明基因型对不定芽的诱导和植 株再生产生着重要影响,在4个品种中只有‘萨蔓莎’能诱导产生正常的不定芽并经 再生形成完整的植株,而另外3个品种的小叶柄基部仅产生了突起无法形成不定芽。 瞿素萍等(2007)对5个切花月季品种的叶片离体培养和再生能力的基因型效应进行 了研究,研究结果表明叶片再生能力相差较大,卡罗拉的直接再生率为56.11%、沃 蒂为55.16%、坦尼克为51.16%、维西利亚为45.10%、巴比伦为35.12%。 因此,适

  宜的激素种类和浓度比值是成功进行月季不定芽诱导的关键,基因型成为了月季直 接再生的限制因素。 此外,可以通过月季不同的外植体先诱导出愈伤组织,愈伤组织再分化不定芽, 但这样的愈伤组织一般无法进行继代增殖且不定芽的诱导率不高,利用此间接途径 进行月季植株再生存在一定的局限性。高莉萍(2004)在以‘萨曼莎’叶片为外植 体进行再生体系建立时,虽然诱导出了能够增殖的愈伤组织,但其再生率仅为3.3%。

  月季的植株再生,既可以通过器官发生途径又可以通过体细胞胚发生途径,但 有关体细胞胚发生途径的研究报道更为多见。以月季Rosa

  canina的离体叶片或茎段为外植体可以获得胚性愈伤组织(Visessuwan

  a1.(1 990)以R.hybrida CV.Domingo和R.hybrida Cv.Vicky

  胞胚诱导研究中,诱导未成熟的叶片或茎段可以获得体细胞胚。Marchant 以月季R.hybrida cv.Trumpeter和R.hybrida

  导得到了体细胞胚。以根为外植体诱导体细胞胚成功的还有月季足hybrida

  der Salm et a1.,1 996)和Rosa Heritage

  2004)。此外,体细胞胚可以通过诱导月季的花瓣获得(Arene et a1.,1993)。一些 月季品种通过原生质体的分离也可以获得体细胞胚并能够再生成为植株(Mathews a1.,1991),而最初通过原生质体分离得到的仅是一些胚性材料(Mathews

  Schum and Hofmann,200 1)。以月季足wichuraiana CV.Heckenzauber和R.wichuraiana

  Charme为材料,用聚乙二醇(PEG)介导原生质体融合方法,通过AFLP

  不同的月季品种和外植体及实验方法被应用于月季体细胞胚发生的研究,结果 表明由于基因型的限制很难找到一种通用的方法进行月季体细胞胚的诱导

  上可以诱导得到次生体细胞胚,这些体细胞胚通过增殖至少可以保存一年。体细胞 胚转移到合适的培养基中后成熟、萌发并形成完整的植株。Kamo

  了ABA对月季R.hybrida CV.Kardinal的体细胞胚成熟的影响。此外,光照条件对月季 体细胞胚的发生产生重要的影响,一般来说,在黑暗条件下才能获得体细胞胚的发 生。同时月季体细胞胚的发生能力因品种、外植体的类型及激素种类和浓度的不同 导致结果差别很大。

  1983年研究者首次利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将外源基 因转入到植物细胞中并获得了抗性植株(Zambryski,1983)。这标志着植物基因工 程时代的到来。自此,植物转基因技术的研究和应用得到了迅速的发展。1984年,

  Paszkowaki利用PEG介导法,将ⅣP丁腊嵌合基因转入到烟草中并获得了成功。1985

  年,Horsch首次建立了农杆菌介导的“叶盘法”遗传转化体系,从而简化了以往以 原生质体为受体的遗传转化方法,具有里程碑的意义。1 987年,Jefferson等利用GUS 报告基因,使遗传转化后的对愈伤组织和植株的检测变得简便而快速,从而使转基 因效率得到很大提高。 同年,美国康耐尔大学的Sanford等发明利用基因枪的遗传

  转化。1988年,Klein首次利用基因枪进行了植物遗传转化的研究,克服了农杆菌介 导法对转化受体种类和基因型的限制。截止至U1997年,全世界通过转基因方法获得 的植株至少涉及T35个科的200多个种植物,其中绝大多数植物为粮食作物、经济作 物、药用植物、果树、蔬菜、观赏植物、林木和牧草(Birch

  年,全球转基因作物种植面积达到了5870万公顷,其中发展中国家为1600万公顷, 占据了全球转基因作物种植面积的27%,而阿根廷、加拿大、美国和中国等4个国家 的种植面积达到了全球总面积的99%(James

  以原生质体、细胞或组织作为受体的直接转移方法,如电激、微注射和PEG介导法 等,利用超声波法和基因枪法将外源DNA直接导入到带有细胞壁的植物细胞,这样 避免了从原生质体到再生植株的过程,从而使遗传转化更为简易快速;(3)种质材 料的基因转移,如通过注射子房、种胚、体细胞胚及花粉等方法导入外源DNA(傅 荣昭等,1994)。其中,农杆菌介导法是目前应用最多的转化方法,在近200种转基 因植物中80%以上是通过根癌农杆菌介导的转化方法获得的(王关林和方宏筠, 2002)。农杆菌介导的遗传转化方法是以农杆菌,包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(4.rhizogenes)为中间载体,农杆菌侵染受伤的植物细 胞后,农杆菌携带的质粒DNA片段即转移DNA(T.DNA)插入到寄主细胞的核基因 组中,从而实现基因转化(王关林和方宏均,2002)。与其它转化方法相比,农杆菌 介导法具有以下优点: (1)受体的类型广泛,可以是原生质体、单细胞、细胞团、

  组织、器官及植株;(2)操作简便易行,周期短,转化效率高且对仪器设备没有特 殊要求; 稳定; (3)可转化的DNA片段较大,转化的外源DNA结构完整且整合位点比较 (4)转化的DNA拷贝数低,外源基因整合到植物体后结构变异较小,转入

  的外源DNA可稳定进行表达(王关林和方宏均,2002)。 农杆菌介导法的实质是T.DNA转移并整合到植株中的过程。影响外源基因的转 移和整合的因素很多,其中包括根癌农杆菌菌株、v/r区活化诱导物的使用、菌液浓 度、植物基因型、外植体类型、预培养、共培养时间、抗生素种类和浓度、pH值、 培养的温度和光照条件。因此,具有高效再生能力的再生体系的建立和对影响外源 基因导入植物细胞的各种因素的优化是植物遗传转化研究的基础。一个成功的遗传 转化体系应满足以下条件: (1)具有一定量具有再生成植株能力的细胞;

  和转化植株再生的操作模式,一个转化系统的效率与转化植株的再生效率和外源基 因转移并整合的效率成正比(Birch,1997;Tang

  用于农杆菌介导法的转化受体材料包括原生质体、单细胞、细胞团、组织、器 官及植株。Song和Sink(2008)以酸樱桃和吉塞拉6号的叶片为转化受体,成功地 获得了含有GUS报告基因的转化植株,其转化率分别3.1%和3.9%。Ce’sag

  (2008)以杏的无菌苗叶片为转化受体,成功地将GFP报告基因整合到植物体中,

  其转化率为5.8%。胚性愈伤和体细胞胚是植物遗传转化中理想的受体材料,因为胚 性细胞接受外源DNA的能力很强,转化后的胚性细胞可发育成为完整的植株,转 化效率高;体细胞胚多为单细胞起源,转化植株的嵌合体少(Poupin

  2005)。同时植物的体细胞胚具有两极性,在发育过程中芽和根可同时分化并形成 完整植株,节省了再生成完整植株的时间。此外,体细胞胚个体间的遗传背景一致、 无性系变异小、胚结构完整、成苗快并且数量大,因此有利于转基因植株的生产和 推广(王关林等,2003)。胚性愈伤和体细胞胚作为转化的受体材料已在很多物种中 得到应用。例如,芹菜(Catlin et

  a1.,1993)、毛曼陀罗(Ducrocq et a1.,1994)、加州罂粟(Park and Facchini,2000)、

  a1.,2000)、花生(Venkatachalam et a1.,2000)、可可(Maximova

  对植物进行遗传转化的先决条件是具有一个可靠而有效的再生系统。目前月季 的再生体系还不过完善,大多数的再生率不高且明显受到基因型的限制,所以有关 月季遗传转化成功的报道非常有限。第一篇关于月季遗传转化的报道是Firoozabady

  a1.(1991)以R.hybrida CV.Royaltyl拘胚性愈伤组织为受体,通过农杆菌介导的方

  节间组织和农杆菌在诱导生根的培养基上共培养得到转化了的不定根,在诱导不定 根的分化产生胚状体,从而得到再生的转化植株。随后,利用农杆菌介导进行月季 遗传转化的研究成为了热点,且有多篇成功报道(Li etal.。2002b;2003)。Marchant

  a1.(1998a)采用基因枪法,以胚性愈伤组织为轰击对象,成功地将水稻的几丁质

  了13%-43%。月季遗传转化也有利用PEG介导法的成功报道,其中原生质体分离所 用的复合物、植物基因型和实验材料的来源、细胞悬浮培养的条件和外源DNA等因 素都对其转化的结果产生重要的影响(Schum

  a1.(2004),在对月季品种‘萨蔓莎’进行农杆菌介导的遗传转化时,以

  叶片作为转化受体没有检测到GUS基因的瞬间表达:用愈伤组织作为转化受体时

  虽然得到了含有报告基因和目的基因的愈伤,但是最终没有得到转化的植株。李敬 蕊(2006)在对月季品种‘萨蔓莎’进行农杆菌介导的转化时,用叶片作为转化受 体得到了抗性芽,但仍然未得到转化植株。

  月季是我国传统十大名花之一,具有“花中皇后"的美誉。月季栽培历史悠久, 具有非常高的观赏价值和商业价值。培育优良的品种是发展花卉产业的制高点,历 来深受研究者的重视。目前世界各地栽培的月季品种多以中国月季为亲本,经过长 期不断的选育和杂交获得,部分杂交后代具有较高的观赏价值,但存在种子萌发率 低的缺点。同时月季花的瓶插寿命比较短,易患白粉病、黑斑病,这些都影响了它 的观赏价值和经济价值。在这些性状改良上,传统育种方法存在着很大的局限性。 因此,在进行常规杂交育种的基础上,应该加强研究品种选育的新技术和新方法的 应用。植物基因工程技术在保持品种的其他性状相对稳定的基础上,能够利用外源 基因对其所控制的性状进行定向改良,从而为培育月季新品种提供了新的途径。而 月季再生体系和遗传转化体系的建立是利用基因工程技术育种的重要基础。 高效而稳定的植株再生体系是植物遗传转化获得成功的重要前提条件。月季可 以通过器官发生途径和体细胞胚发生途径成功地获得再生植株。国内外的研究者对 月季再生体系建立和遗传转化进行了大量的研究,研究结果表明月季植株再生多数 表现出再生率不高,且明显受基因型限制。因此有关月季遗传转化研究的报道还非 常有限。其受体材料有叶片,愈伤组织,胚性愈伤,这其中只有胚性愈伤组织有成 功的报道。而用愈伤组织和叶片作为受体的都没有获得转化的植株。 本研究针对上述现象,对月季叶片直接再生体系进行优化,使植株再生率能够 稳定的提高以满足遗传转化的要求;同时以不同外植体进行月季体细胞胚的诱导, 从而建立月季体细胞胚发生途径的再生体系。并在此基础上,利用叶片直接再生系 统和体细胞胚发生再生系统两种再生体系进行月季遗传转化的研究,从而为目的基 因的转化打下坚实的基础。 月季原产我国,拥有许多优良的种质资源。通过月季不同途径再生体系的建立, 利用遗传转化技术对月季观赏性状进行定向改良,完全可以培育出具有较高商业价 值和自主知识产权的月季新品种。

  月季叶片来源广泛,取材受季节的限制性较小,是进行月季遗传转化的良好受 材料。建立一个高效的遗传转化体系的前提是高效再生体系的建立。因此国内外 研究者就叶片离体培养和植株再生体系建立进行了大量的工作。 月季的叶片具有可以直接诱导不定芽并再生成植株的能力,但影响不定芽诱导 植株再生的因素很多,主要包括基本培养基、培养条件、叶片接种方式、叶片生 状态,基因型、植物生长调节剂的种类和浓度组合。研究者通过对叶龄、光照、 培养时间和空气湿度等条件进行优化,从而使试管苗叶片的再生能力得到了明显 高(Ibrahim

  Debergh,2000;2001)。任桂芳等(2004)对13个月季切花品种的

  片再生能力进行了研究,仅有6个品种得到再生植株。本实验室高莉萍(2004)以 季‘萨蔓莎’叶片为材料,研究了基因型、外植体、叶位及暗培养时间等条件对 定芽诱导和植株再生的影响, ‘萨蔓莎’再生率达到了40%.50%。李敬蕊(2006)

  在此基础上进行了碳源对‘萨蔓莎’植株再生影响的研究,使‘萨蔓莎’再生率达 到了60%。 在本实验中,通过研究暗培养时间、基因型与TDZ和NAA不同浓度组合对月季 植株再生的影响,极大地提高了月季不同品种的小叶片不定芽诱导效率和植株再生 效率。

  4月中旬,采取生长在华中农业大学花卉基地内的生长健壮,无病虫害的优良月 季品种‘伊丽莎白’、‘黑夫人’的未展开的复叶片作为优化再生体系的试验材料。 同时取已建立微繁体系的月季品种‘萨蔓莎’无菌苗的未展开的复叶片作为优化再 生体系的试验材料。微繁体系的建立参考高莉萍(2004)的方法。

  实验材料均置于24士2。C,光照强度401amol m-2 s-1,光照周期为14h的条件下进 行培养,或直接置于黑暗处培养。 实验所用基本培养基为MS(Murashige and Skoog,1962)和1/2MS,添加不同种

  类和浓度的植物生长调节剂(李敬蕊,2006)。培养基灭菌前用1 mol/LNaOH或1 mol/LHCI将pH调至5.8—6.0,121。C高压灭菌20 rain。其中AgN03和GA3采用过滤灭菌, 待培养基灭菌后冷却至55.650C时加入,其他植物生长调节剂均在培养基灭菌前添

  MS-H}.5mpdL BA+O.004mg/L NAA+0.1 mg/L

  1.3.1外植体消毒 取月季品种‘伊丽莎白’、‘黑夫人’的幼嫩复叶,自来水冲洗30min,在超净 工作台上用70%的酒精消毒30s,0.1%升汞消毒8min,无菌水冲洗3-4次,用无菌滤 纸吸干表面液体。将未展开的幼嫩复叶自小叶柄处切成带有小叶柄的单叶,作为接 种材料。 1.3.2暗培养时间对月季品种‘萨蔓莎’植株再生的影响 取月季品种‘萨蔓莎’无菌苗未展开的幼嫩复叶,自小叶柄处将其切成带有小 叶柄的单叶,以叶背面朝下接种于诱导培养基(表2.2)。分别黑暗培养5d,10d, 15d后转入光照条件下培养,20d后统计不定芽诱导率,并转入扩繁培养基上培养(表 2.2)。培养40d后,不定芽发枝成苗,统计植株再生率。比较暗培养时间对月季品 种‘萨蔓莎’植株再生的影响。 1.3。3基因型与TDZ和NAA不同浓度组合对月季植株再生的影响 将月季品种‘萨蔓莎’、 ‘伊丽莎白’、 ‘黑夫人’的小叶片分别接种于含有

  不同浓度TDZ(O.5,1.0,1.5,2.0 mpJL)和NAA(O.01,0.05 mg/L)的诱导培养基上。 暗培养10d后转入光照条件下培养,培养20d后统计不定芽诱导率,并转入扩繁培养

  基上培养,40d后统计植株再生率。比较基因型与不同激素组合对月季植株再生的影

  Table 2.2 Different combination of TDZ and NAA

  以上实验均设有3次重复,每次重复为30.36个外植体。培养20d后统计叶片的不 定芽诱导率,培养40d后统计植株再生率。统计方法如下: 不定芽诱导率(%)=生成不定芽的叶片数/接种的叶片数x100% 植株再生率(%)=抽生出枝条的叶片数/接种的叶片数×100%

  统计标准为芽俊0.5CM,枝高21.OCM。采用SAS软件对所有数据进行方差分析,

  Table 2-3 Effect of dark time of culture

  注:数据显示为平均值士标准误,不同字母表示在P<O.05水平上差异显著。下同。

  Note:values shown level of significance following table.

  means-士standard errors.values significantly different within columns at the 5% indicated with different small letter,which have same meanings in the

  将月季品种‘萨蔓莎’、 ‘伊丽莎白’、 ‘黑夫人’的小叶片分别接种在加入

  不同浓度TDZ和NAA组合的诱导培养基。通过统计不定芽诱导率和植株再生率比较 基因型与不同激素组合对月季植株再生的影响。本实验结果如表2-4所示:3个月季 品种的小叶片不定芽的诱导能力存在着显著差异,其中‘伊丽莎白’小叶片不定芽 诱导能力最强,最高诱导率为95.30%, ‘萨蔓莎’不定芽的最高诱导率为85.04%,

  ‘黑夫人’不定芽的最高诱导率为81.70%;TDZ和NAA不同浓度组合对不定芽诱导 率的影响也存在显著差异,在培养基T2N2(1.0mg/LTDZ+0.5mg/LNAA)上3个月季 品种的小叶片不定芽诱导率都显著高于其他组合,因此最适合进行月季小叶片不定 芽的诱导。 同时如表2.5所示:3个月季品种的植株再生能力, ‘萨蔓莎’、 ‘伊丽莎白’

  无显著差异,但与月季‘黑夫人’存在显著差异;其中‘伊丽莎白’植株再生率最 高为64.49%, ‘萨蔓莎’植株再生率最高为60.09%, ‘黑夫人’植株再生率最高为

  55.33%;TDZ和NAA不同浓度组合对植株再生的影响也存在显著差异,同样在培养 基T2N2(1.0mg/L 他组合。 基因型与TDZ和NAA不同浓度组合的实验结果表明:在同一培养基上,小叶片 不定芽诱导率与植株再生率不存在正相关,即不定芽诱导率高的培养基其植株再生

  73.68-士1.1 8b 33.66士2.13c 81.70士1.71a 54.30士1.41d 46.15士1.74e 57.61-4-1.15d 36.75士2.12f 55.95b

  37.94+1.56e 57.19生1.57c 85.04=t=1.67a 47.23士2.28d 77.68士2.63b 35.064-1.77e 1 9.40士1.77f 46.82c

  86.68士2.49b 34.95:t:2.49h 95.30士1.89a 70.13-4-2.07e 57.37.4-1.91e 65.07士1.57d 39.39士2.1 lg 62.77a

  66.10b 41.939 87.34a 57.22d 60.40c 52.58e 31.85h

  Table 2-5 Effect of genotypes and different combinations of TDZ and NAA on plant

  26.74士3.02e 34.55士2.20b 12.08士1.09f 55.33士1.86a 21.70士1.67d 16.64士1.36e 12.97士1.72f 5.61士1.049 23.20b

  a:不定芽抽生成枝条; b:含有花苞的再生植株 leaflets嬲explants

  a:Branchs formed from adventitious buds;b:Plantlet with bud

  叶片直接分化不定芽发育成植株是一个极其复杂的脱分化和再分化过程,体现 了植物的再生能力。影响月季叶片再生能力的因素有很多,其中包括暗培养时间、 基本培养基、碳源、外植体状态、基因型和植株生长调节剂等。研究表明,基因型 是影响月季再生能力的首要因素。

  有关叶片的再生研究结果表明,黑暗培养对不定芽的诱导起着重要作用。暗培 养时间过短,则不能诱导不定芽的发生;暗培养时间过长,则会促进愈伤组织的发 生,不能直接诱导生成不定芽。高莉萍(2004)以‘萨蔓莎’叶片为外植体进行研

  究时,分别暗培养7d,8d,9d,10d,1l帅12d,结果暗培养8d对小叶片不定芽的诱

  导效果最好,再生率为33.3%。李敬蕊(2006)以‘萨蔓莎’叶片为外植体进行研究 时,分别暗培养10d,15d,20d,25d,结果暗培养15d的小叶片不定芽诱导率最高为 65%左右,并且暗培养15d,20d,25d的小叶片的不定芽诱导率不存在显著性差异。 本实验以‘萨蔓莎’小叶片为外植体进行研究时,分别暗培养5d,10d,15d,结果

  暗培养10d的不定芽诱导率最高达到77.68%,且不同暗培养时间不定芽诱导率存在显 著性差异。实验结果与上述研究结果存在差异可能是因实验方法不同导致的。上述 的两位研究者在小叶片暗培养结束后直接将外植体从诱导培养基转入扩繁培养基进 行光照条件下培养,本实验在黑暗培养结束后先转入光照条件下培养,20d后统计不 定芽诱导率再转入扩繁培养基上培养。因此,可以采用此方法提高月季小叶片不定 芽诱导率和植株再生率。

  基因型是影响月季小叶片再生能力的首要因素。瞿素萍等(2007)对5个切花月季 品种‘卡罗拉’、 ‘维西利亚’、 ‘坦尼克’、 ‘巴比伦’、 ‘沃蒂’的叶片离体培

  养和再生能力的基因型效应进行了研究,结果表明不同切花月季品种的小叶片直接再 生能力存在显著差异, ‘卡罗拉’直接再生率最高,达N56.1%,而‘巴比伦’仅达到

  35.2%。李敬蕊(2006)对15个切花月季品种的小叶片不定芽诱导能力和植株再生能力 进行了研究,研究结果表明在同一培养基上,不同月季品种的小叶片植株再生率存在 显著差异。同时不定芽诱导率较高的品种其植株再生率也相应较高。任桂芳等(2004) 对13个月季切花品种的叶片再生能力进行了研究,仅有6个品种得到再生植株。 本实验以月季品种‘萨蔓莎’、 行了研究,其结果‘萨蔓莎’、 ‘伊丽莎白’、 ‘黑夫人’小叶片为外植体进

  植物生长调节剂的种类和浓度配比也是影响月季叶片再生能力的重要因素。李 敬蕊(2006)对15个切花月季品种的小叶片不定芽诱导能力和植株再生能力进行了 研究,细胞分裂素BA虽能诱导月季小叶片产生不定芽,但未获得再生植株。瞿素萍 等(2007)的研究结果也表明叶片直接再生培养以TDZ的效果最好,明显优于BA。 本实验研究了TDZ和NAA不同浓度组合对3个月季品种再生能力的影响。研究结 果表明,不同浓度组合的植株再生率存在显著差异。在同一浓度组合的培养基上, 小叶片不定芽诱导率与植株再生率不存在正相关,即不定芽诱导率高的浓度组合其 植株再生率不一定也高。表明不同浓度TDZ和NAA组合对不定芽生长状态也产生了 影响,即不是所有的不定芽都具有抽生成枝条并再生成植株的能力。

  植物的体细胞胚发生是植物的体细胞在离体条件下,通过与合子胚类似的发育 途径得到新个体的过程。体细胞胚发生途径再生体系的建立有助于月季的试管苗快 繁,人工种子的生产和冷藏保存,同时胚性细胞是进行月季遗传转化的最佳受体, 可以以体细胞胚为受体进行月季遗传转化的研究。 高效而稳定的体细胞胚诱导和植株再生对提高植物的遗传转化效率起着重要作 用。影响体细胞胚发生的因素很多,主要包括基因型、外植体类型、基本培养基种 类、植物生长调节剂种类和浓度及培养条件等。 月季的体细胞胚可通过直接途径发生。在本实验中,通过研究基因型、外植体 类型和植物生长调节剂种类和浓度及培养条件等因素对月季体细胞胚诱导、体细胞 胚增殖与保存和植株再生的影响,成功地建立了月季体细胞胚发生途径再生体系。 为月季的遗传转化研究打下了基础。

  4月中旬,采取生长在华中农业大学花卉基地内的生长健壮,无病虫害的优良月 季品种的未展开的复叶片作为月季体细胞胚诱导的外植体。同时取已建立微繁体系 的月季无菌苗的未展开的复叶片作为月季体细胞胚诱导的外植体。 采取生长在华中农业大学花卉基地内的生长健壮,无病虫害的优良月季品种的 未成熟果实(自由授粉后8周),消毒后在无菌条件下剥取未成熟合子胚作为外植体。 以叶片为外植体的23个月季品种如表3.1所示,其中‘蒙特苏玛’、‘珍爱玫瑰’、 ‘水上芭蕾’、 ‘萨蔓莎’、 ‘蓝色天堂’、 ‘伊丽莎白’、 ‘维蒂利亚’和‘红丝绒’为继代2.3年的组培苗, ‘黑夫人’为继代半年的组培苗。其余月季品种均为

  生长在花卉基地内的生长健壮,无病虫害的优良植株。 以未成熟合子胚为外植体的10个月季品种为‘萨蔓莎’、 白’、‘紫雾’、 ‘黑夫人’、 ‘伊丽莎 ‘小

  红色 白色,带宽红边 粉色 深黄色 白色 黑红色 艳红色 黄色 深红,有绒光 黄色,透明 红色 红色 橘红 浅蓝紫色

  注:Cl:藤本月季,Climbing Roses:Gr:大花月季,Grandiflora Roses:HT:杂交香水月季,

  Roses:Min:微型月季,Miniature Roses:加一为资料不详。

  实验材料均置于24士2。C,光照强度40 行培养,或直接置于黑暗处培养。 实验所用基本培养基为MS(Murashige

  类和浓度的植物生长调节剂,309/L葡萄糖(部分除外),2.59/L植物凝胶。培养基灭 菌前用1 mol/LNaOH或1

  ABA、GA3采用过滤灭菌,待培养基灭菌后冷却至55.650C时加入,其他植物生长调 节剂均在培养基灭菌前添加。

  1.3.1外植体消毒 叶片消毒及处理方法同第二章(1.3.1)。 果实处理方法:将采集的月季果实切开,取出其内种子,挑选在清水中能下沉 的饱满种子。自来水冲洗30min后放入混合液(浓硫酸:水=3:2)中浸种30min。在 超净工作台上用70%的酒精消毒40s,然后再用0.1%升汞消毒10rain,无菌水冲洗3-4 次。剥取未成熟合子胚作为外植体。 1.3.2基因型与不同浓度2,4-D对月季体细胞胚发生的影响 将不同的月季品种的小叶片分别接种在含有不同浓度2,4.D(0,1.0,2.0,3.0,4.0,

  基上,暗培养8周后统计体细胞胚诱导率。比较基因型与不同浓度2,4.D对月季体细 胞胚发生的影响。 1.3.3基因型与2.4-D和BA不同浓度组合对月季体细胞胚发生的影响 将不同的月季品种的未成熟合子胚分别接种在含有不同浓度2,4.D(0,1.0,2.0,

  到相同的新鲜培养基,暗培养8周后统计体细胞胚诱导率。比较基因型与2,4一D和BA 不同浓度组合对月季体细胞胚发生的影响。

  1.3.4培养条件对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响 1.3.4.1光照条件对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响 将诱导所得的月季‘萨蔓莎’体细胞胚接种到MS+1.0mg/L 2,4.D培养基上, 葡萄糖为309/L,植物凝胶为2.59/L。置于黑暗条件或光照条件下培养。4周后观察体 细胞胚的生长情况,比较光照条件对体细胞胚生长状态的影响。 1.3.4.2碳源对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响 将诱导所得的月季‘萨蔓莎’体细胞胚接种到MS+1.0mg/L 2,4-D培养基上, 其中蔗糖浓度为309/L,609/L或葡萄糖浓度为309/L,609/L,植物凝胶为2.59/L。置 于光照条件下培养。4周后观察体细胞胚的生长情况,比较不同碳源及浓度对体细胞 胚生长状态的影响。 1.3.4.3外源激素对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响 将诱导所得的月季‘萨蔓莎’体细胞胚接种到含有不同浓度2,4.D(0,O.5,1.0 mg/L)和BA(0,0.05 mg/L)的MS培养基上,葡萄糖浓度为609/L,植物凝胶为2.59/L。 置于光照条件下培养。4周后观察体细胞胚的生长情况,比较外源激素对体细胞胚生 长状态的影响。 1.3.5体细胞胚的荫发和植株再生 1.3.5.1月季‘萨蔓莎’体细胞胚的萌发和植株再生 将生长健壮的月季 ‘萨蔓莎’体细胞胚分别接种到不同的培养基上,培养基配

  方如表3.2所示。置于光照条件下培养,8周后统计体细胞胚萌发率并转入到相同的 新鲜培养基上培养,继续培养4周后统计单位体细胞胚成苗率。每4周更新一次培养 基。 1.3.5.2月季‘紫雾’及藤本月季体细胞胚的萌发和植株再生 将生长健壮的月季 ‘紫雾’及藤本月季的体细胞胚分别接种到不同的培养基

  上,培养基配方如表3.3所示。置于光照条件下培养,8周后统计体细胞胚萌发率并 转入到相同的新鲜培养基上培养,继续培养4周后统计单位体细胞胚成苗率。每4周 更新一次培养基。

  Table 3-2 List of culture medium of Rosa hybrida‘Samantha’

  Table 3-3 List of culture medium of‘Purple Haze’and Climbing

  以月季的小叶片为外植体诱导体细胞胚发生,在所供试的实验材料中,只有月季‘萨 蔓莎’的小叶片叶柄处有体细胞胚直接发生,其余月季品种的小叶片均无体细胞胚 发生,小叶片在培养过程中褐化死亡。不同浓度2,4.D对月季‘萨蔓莎’体细胞胚发 生的影响实验结果如表3-4所示:2,4.D浓度在0.2mg/L时,小叶片的叶柄处膨大,在 继续培养的过程中褐化死亡;2,4.D浓度为3mg/L和4mg/L时,小叶片的叶柄处有体 细胞胚发生;2。4.D浓度在5.8mg/L时,小叶片有不定根生成。

  子胚有的发生褐化死亡 体细胞胚的最高诱导率 据未统计。基因型与2, 性差异。

  Table 3-4 Effect of different 2.4一D concentrations

  表3.5 2,4.D和BA不同浓度组合对月季‘紫雾’和藤本月季体细胞胚发生的影响

  Table 3-5 Effect of different combinations of 2,4-D and BA

  embryogenesis in Rosa hybrida‘Purple Haze’and Climbing

  将诱导所得的体细胞胚接种到MS+1.0mg/L 2,4.D培养基上培养,体细胞胚以 重复性的体细胞胚发生方式进行增殖,且增殖效果显著,未得到胚性愈伤组织。但 在增殖过程中,有畸形胚的生成且部分体细胞胚出现非胚性愈伤化,且颗粒性消失。 因此,本实验以月季‘萨蔓莎’体细胞胚为材料进行了以下研究。 2.3.1光照条件对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响 将体细胞胚培养于成分相同的培养基上,分别置于黑暗条件和光照条件下培养, 其体细胞胚生长状态存在显著的差异。光照条件下培养时体细胞胚生长状态显著优 于黑暗条件。光照条件下,体细胞胚生长旺盛,增殖效果明显,体细胞胚光泽度好, 体细胞胚组织比例(每个体胚团上体胚百分比的平均值)达70%以上;在黑暗条件 下,体细胞胚生长弱,无明显增殖,水渍状明显,甚至部分体细胞胚褐化死亡。因 此,月季体细胞胚的增殖与保存应选择在光照条件下培养。 2.3.2碳源对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响 将体细胞胚接种到MS+1.0mg/L 2,4.D培养基上,其中蔗糖浓度为309/L,609/L 或葡萄糖浓度为309/L,609/L,置于光照条件下培养。4N后,体细胞胚生长状态存 在明显差异,如表3.6所示。体细胞胚在葡萄糖609/L的培养基上生长最旺盛,其次 是蔗糖609/L,葡萄糖309/L,蔗糖309/L;增殖效果在葡萄糖309/L的培养基上最明显, 增殖系数为4.35,其次是葡萄糖609/L,蔗糖609/L,蔗糖309/L,体细胞胚光泽度在 葡萄糖609/Ll约培养基上最优,其次是蔗糖609/L,葡萄糖309/L,蔗糖309/L;体细胞 胚组织比例在葡萄糖609/L的培养基上达到85%以上,其次在葡萄糖309,'L的培养基 上,体细胞胚组织比例达到70%以上,在含有蔗糖的培养基上,体细胞胚发生明显 的非胚性愈伤化,畸形胚发生严重。因此综合考虑,应选择含有葡萄糖609/Ll拘培养 基进行月季体细胞胚的增殖与保存。 2.3.3外源激素对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响 将体细胞胚接种到含有不同浓度2,4.D(0,O.5,1.0mg/L)和BA(0,0.05mg/L)的 MS培养基上,葡萄糖浓度为609/L,植物凝胶为2.59/L。置于光照条件下培养。4N 后比较外源激素对体细胞胚生长状态的影响。其结果如表3.7所示:当2,4.D浓度过 低时,体细胞胚长势弱,增殖缓慢且愈伤化严重。体细胞胚在含有1.0mg/L

  胞胚组织比例达90%以上,因此适合月季体细胞胚的增殖与保存。 表3-6碳源对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响

  Table 3-6 Type and concentration of carbohy’drate

  表3—7 2,4-D和BA不同浓度组合对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响

  Table 3-7 Effect of different combinations of2,4-D and BA

  somatic embryos in Rosa hybrida‘Samantha’

  体细胞胚生长较弱,增殖系数为1.67, 体细胞胚愈伤化 体细胞胚生长较弱,增殖系数为2.13,

  体细胞胚生长较好,增殖系数为2.78, 有萌发现象 体细胞胚生长较好,增殖系数为3.38, 有萌发现象 体细胞胚生长旺盛,增殖系数为3.81,体细胞胚组 织比例达85%以上 体细胞胚生长旺盛,增殖系数为4.58,体细胞胚组

  图3一l在MS+I.0m#L 。

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